（3） 樣本采集與處理

在養殖28和56 d時各采樣1次，其中28 d時僅測定體長、體重，并每桶取3條魚解剖取肝臟稱重。取樣前停食24 h，先對各桶魚進行計數，稱重，測量體長，計算特定生長率。每桶取3尾規格基本一致的魚，先用MS⁃222麻醉，然后用70%酒精擦拭魚體表面，在超凈臺內無菌操作，解剖、分離并取出肝臟，對肝臟稱重，分離并取出中后腸段的內容物，然后用滅菌解剖刀刮取腸道內側黏膜，與內容物混合后，液氮速凍，-80℃保存。

（4）生長指標的計算

增重率（%）=[（終末體重–初始體重）/初始體重] ×100

特定生長率（%/d）= [（ln終末體重–ln初始體重）/養殖天數] ×100

肝體指數（%）=（肝體重/體重）×100

（5） 腸道菌群多樣性的測定

取約0.5 g腸道內容物與黏膜混合樣品，按照使用MP⁃bio土壤DNA提取試劑盒說明提取細菌基因組，將提取的DNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用Nanodrop對DNA的濃度和OD260 nm/OD280 nm值進行測定。

首先針對16S rRNA基因的V3 ~ V4區設計引物，引物兩端帶有12 bp的barcode，用以識別不同樣品的序列。然后進行PCR擴增，程序如下：95 ℃預變性3 min，之后進入擴增循環，循環數27，循環過程為95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后是72 ℃延伸10 min。擴增產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收產物；使用Illumina測序專用的NEB NextUltraTM DNA Library Prep Kit試劑盒按照說明建立基因克隆文庫。構建好的文庫經過Qubit定量和檢測合格后，基于Illumina Miseq PE300平臺進行高通量測序（上海美吉生物工程有限責任公司）。

使用Usearch (version 7.0)軟件( http://drive5.com/uparse/)，將所得序列根據97%相似度關系進行操作分類單元(OTU)聚類分析，產生OTU表，并與Silva數據庫(http://www.arb⁃silva.de)比對進行分類學分析，所用平臺為Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy. html)，統計后得到各樣本的群落組成。然后對群落進行基于OTU水平的α多樣性分析，所用軟件為Mothur(version v.1.30.1，http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，分析指標包括Sobs指數、Shannon指數、Chao指數、Simpson指數、Ace指數以及覆蓋度(coverage)。腸道菌群組成分析及熱圖使用R語言工具作圖，主成分分析(PCA)采用R語言的vegan軟件包進行分析和作圖。

（6）數據統計與分析

試驗數據經Excel 2007軟件初步整理后，使用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one⁃wayANOVA)，采用Tukey法進行平均值間的多重比較，P<0.05為差異顯著，描述性統計值以平均值±標準差(mean±SD)表示。

2. 結果與分析

（1）植物乳桿菌對細鱗鮭生長的影響

由表2可知，經過56 d的養殖，對照組試驗魚體重為(18.23±0.45) g/尾，試驗組試驗魚體重為(19.08±0.14) g/尾，組間差異顯著(P <0.05)；試驗組的增重率在養殖28及56 d時均顯著高于對照組(P<0.05)。試驗組的特定生長率在養殖28及56 d時均顯著高于對照組(P

（2） 基于16S rRNA 基因測序的α多樣性

獲得原始序列數1228410條，經過質量控制，包括去除質量值低于20的尾部堿基及含氮的堿基，根據雙端序列間的重疊關系進行序列拼接，通過末端條形碼識別得到每個樣本的序列，最終得到優化序列數312339條，平均序列長度為444.85bp。其中對照組獲得的有效序列數為43165條，試驗組獲得的有效序列數為58910條，2組之間差異顯著(P<0.05)(表3)。在后續分析中，為降低統計誤差，將每個樣本序列數抽平至37818條。

各組的覆蓋度均約等于1.00，說明了該測序結果已基本覆蓋樣本的多樣性。基于97%相似性水平劃分得到810個OTU，它們分別歸屬644個種、454個屬、213科、113目、53綱、26門。α多樣性指數包括Sobs指數、Shannon指數、Simpson指數、Ace指數、Chao指數，對對照組和試驗組α多樣性指數的平均值進行顯著性分析，結果顯示2組之間上述指標均存在著顯著差異(P < 0.05)(表3)。此外，Sobs指數由對照組的439降低到試驗組的196，組間差異顯著(P<0.05)(表3)，表明植物乳桿菌的添加顯著降低了樣本中所觀察到的物種數目；Shannon指數由對照組的4.0183降低到了試驗組的1. 3275，Simpson指數由對照組的0.0986升高到了試驗組的0.4029，表明對照組細鱗鮭腸道菌群多樣性較試驗組腸道高，植物乳桿菌的添加顯著降低了細鱗鮭腸道菌群多樣性；Chao指數由對照組的446.2992降低到了試驗組的249.3476，Ace指數由對照組的443.7244降低到了試驗組的251.1307，表明對照組細鱗鮭腸道菌群物種豐富度較試驗組高，植物乳桿菌的添加顯著降低了細鱗鮭腸道菌群物種豐富度。稀釋曲線(圖1)顯示，各樣本曲線均已進入平臺期，表明測序深度可靠，能夠真實反映樣本中大多數微生物組成情況。

（3） 植物乳桿菌對細鱗鮭腸道菌群組成的影響

在門水平上，試驗組腸道菌群中，厚壁菌門的豐度達96.03%，占絕對優勢，變形菌門的豐度為2.54%，其他門類的豐度均低于1%。對照組腸道菌群中，厚壁菌門的豐度為23.79%，相比試驗組差異顯著(P< 0.05)，藍細菌門(Cyanobacteria)的豐度為23.30%，擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度為8.95%，螺旋菌門(Spirochaetae)的豐度為6.67%，放線菌門(Actinobacteria)的豐度為5.35%，豐度低于1%的物種的總豐度很高，達到41.28%。

在屬水平上，對照組和試驗組腸道菌群組成差別也很大。對照組中豐度在1%以上的屬有11個，豐度低于1%的屬的總豐度達41.76%，其中豐度相對較高的菌屬有未命名_藍細菌門(norank_c_Cyanobacteria)(23.30%)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)(11.70%)、短螺旋體屬(Brevinema) (6.67%)、普氏菌屬(Prevotella)(3.90%)和乳桿菌屬(Lactobacillus)(2.89%)。而試驗組中豐度高于1%的菌屬僅有3個，以乳桿菌屬的豐度最高，占58.94%，微小桿菌屬(Exiguobacterium)占26.00%，腸球菌屬(Enterococcus)占10.62%，其他豐度低于1%的菌屬的總豐度僅占4.44%。

（4） 植物乳桿菌對細鱗鮭腸道菌群β多樣性的影響

三維PCA圖(圖4)顯示，來自試驗組和對照組的腸道菌群樣本分別聚類成2 個群體，這種聚類主要體現在主成分1(PC1)上，PC1坐標軸的影響因素占總成分的73.89%。Venn圖（圖5）分析顯示，在所有樣本的1107個OTU中，共有OTU數為359個，占OTU總數的32.40%；對照組特有OTU數達到了418個，占OTU總數的37.80%；而試驗組特的OTU數為34個，僅占OTU總數的3.10%。試驗組OTU數（393個）遠少于對照組（777個），使得物種豐富度降低約49.42%。

為反映細鱗鮭腸道菌群與植物乳桿菌處理的關系，進行了熱圖構建分析(圖6)，圖中不同的顏色代表了不同菌群的豐度，左側代表基于屬水平的菌群系統發育進化樹，圖中頂端代表樣品聚類關系。熱圖顯示，對照組的3個樣本彼此臨近，而試驗組的3個樣本彼此臨近，2組樣本各自聚類成1個群體，結合菌群的進化關系，說明2組細鱗鮭腸道菌群組成差別明顯。從熱圖還可以看出，添加植物乳桿菌導致許多菌屬受到抑制甚至從腸道菌群中消失，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、桿菌屬(Geobacillus)、梭菌科-1屬(Clostridiaceae_1)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、副伯克氏菌屬(Paraburkholderia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、普氏菌屬等。此外，相比對照組，試驗組中腸球菌屬、乳桿菌屬、微小桿菌屬這3個菌屬的豐度增加明顯。與之對應的是，Venn圖顯示多達284個OTU從試驗組中消失(圖5)，說明添加的植物乳桿菌在細鱗鮭腸道內抑制了多種菌群的生長，改變了其菌群組成。

3. 討論

健康的腸道菌群結構對動物多種生理機能有重要的影響，如營養吸收、生長發育、免疫調節、疾病預防等。本研究發現，雖然添加植物乳桿菌未對細鱗鮭的體長產生顯著影響，但對細鱗鮭的體重有一定的促進作用，在養殖期28和56d時均提高了特定生長率。Carnevali等使用德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)投喂歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)，經25和59 d養殖后，發現其增重率分別比對照組提高了28%和81%。Lee等用戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)飼喂日本鰻鱺(Anguilla japonica)，5周后發現在特定生長率、飼料轉化率及存活率方面均顯著優于對照組。

Illumina高通量測序技術測序深度大，對菌群多樣性的反應準確、全面，在魚類腸道菌群研究中獲得了廣泛應用。李建柱等采用高通量測序技術分析了養殖池塘鰱魚、鳙魚、鯽魚、草魚的腸道菌群組成，OTU數最低298個，最高412個，Shannon指數介于2. 21 ~ 3. 09。黃麗麗等在新疆額爾齊斯河流域的3種野生冷水魚（哲羅魚、細鱗鮭及黑斑狗魚）的6個樣品中共得到了58328條有效序列，OTU 數共242個。本研究中，6個樣本共獲得了有效序列數612446條，其中試驗組（58909條）有效序列數多于對照組（43164條），對照組OTU數777個，試驗組OTU數393個，且物種多樣性和豐富度方面對照組遠大于試驗組，說明益生菌植物乳桿菌降低了養殖細鱗鮭腸道菌群多樣性，使其菌群種類向簡單化發展。

魚類腸道菌群組成受宿主種類、發育時期、環境和飼料影響而有所差異。對新疆額爾齊斯河流域野生細鱗鮭腸道菌群組成的研究發現，變形菌門是細鱗鮭腸道菌群中的優勢菌門，屬水平上以嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、梭菌屬(Clostridium)等的比例較高。本研究發現，養殖細鱗鮭腸道微生物種類豐富，優勢菌門也是變形菌門，此外，厚壁菌門及藍細菌門的豐度也很高；在屬水平上與野生細鱗鮭差別較大，以勞爾氏菌屬、短螺旋體屬、普氏菌屬等的豐度較高。Lyons等同樣使用高通量測序技術研究了虹鱒的腸道菌群組成，發現γ-變形菌門占優勢，其中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的耶爾森氏菌屬(Yersinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、哈夫尼菌屬(Hafnia)和肥大桿菌屬(Obesumbacterium)等優勢明顯。總結來說，變形菌門是冷水魚腸道菌群中常見的優勢菌門，而在屬水平上隨著種類、養殖環境的變化差異更大。

本研究表明，飼料中添加植物乳桿菌使細鱗鮭腸道菌群中益生菌的豐度增加，其中乳桿菌屬的豐度由對照組的2. 89%提高到了試驗組的58.94%，增加了近20倍。此外，微小桿菌屬、腸球菌屬也占有很高的比例，它們均屬厚壁菌門的產乳酸菌。這些菌屬所占比例的增加使得試驗組腸道菌群中厚壁菌門的豐度達到了98%以上。微小桿菌屬能夠利用糖類發酵產酸，主要產乳酸、乙酸和甲酸，該屬很多種類被開發為益生菌，用于環境改良。腸球菌屬也是乳酸菌家族的重要成員，來自該屬的許多乳酸菌用于食品發酵及維持動物腸道健康等，特別是糞腸球菌，是該屬中最具代表性的益生菌，該菌不但可以產生乳酸，還可以分泌細菌素，抑制有害菌群的發展。而乳酸菌作為益生菌也被廣泛用于調控動物腸道菌群，增強宿主免疫力，抑制有害菌群，改善動物營養吸收、生長、發育與繁殖等。類似的研究結果也在鯽魚、羅非魚及虹鱒等魚類的腸道菌群研究中得到證實，表明植物乳桿菌對魚類腸道乳酸菌數量的提高具有顯著的效果。

物種豐富度是指群落中物種數目的多少，本試驗結果表明植物乳桿菌使細鱗鮭腸道菌群物種數目變少，在OTU水平上顯示49.42%的OTU由于植物乳桿菌的添加而從腸道菌群中消失，表明植物乳桿菌抑制了許多腸道菌群的生長，降低了細鱗鮭腸道菌群的多樣性。而這些消失的菌群很多是腸道內有害的革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌屬、短螺旋體屬、桿菌屬、梭菌科、芽孢桿菌屬、副伯克氏菌屬、鏈球菌屬及類諾卡氏菌屬等。植物乳桿菌對藍細菌門的抑制作用也很顯著，其豐度從對照組的23.3%降低到了試驗組的<1%。藍細菌是一類廣泛存在于環境中的古老菌群，經常在動物腸道內檢測到。藍細菌并非魚類腸道固有微生物，而是來自餌料攜帶或水環境。對鯽魚的研究也發現，益生菌在增加乳酸菌豐度的同時，顯著降低了另外一些細菌的豐度，如好氧菌及產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。

本試驗通過在飼料中添加植物乳桿菌研究益生菌對細鱗鮭腸道菌群多樣性的影響，揭示了養殖模式下細鱗鮭腸道菌群的組成及其益生菌調控效應，為今后在魚類腸道微生物菌群調控技術方面以及在腸道微生物層面上研究冷水魚營養與生長、免疫與疾病等提供參考。

4． 結論

① 飼料中添加植物乳桿菌可以顯著提高細鱗鮭的特定生長率。

② 養殖細鱗鮭腸道菌群在門水平上以變形菌門、厚壁菌門和藍細菌門為主；在屬水平上分布較均勻，勞爾氏菌屬、短螺旋體屬、普氏菌屬的豐度較高但未形成優勢菌屬，菌屬種類繁多且豐度都較低。

③ 飼料中添加植物乳桿菌顯著改變了細鱗鮭腸道菌群組成，在門水平上厚壁菌門占絕對優勢，在屬水平上乳桿菌屬占優勢，未命名＿藍細菌門豐度明顯下降。　　

④ 綜合認為，飼料中添加植物乳桿菌可使細鱗鮭腸道菌群物種多樣性和豐富度降低，益生菌豐度增加，并可促進細鱗魚生長。

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